제목: 개의 분변에서 단방조충(Echinococcus granulosus) 검출을 위한 재조합효소 중합효소 연쇄반응(RPA)-CRISPR/Cas12a 분석법 개발및검증 배경: 낭성포충증(Cystic echinococcosis, CE)은 단방조충(Echinococcus granulosus sensu lato, E. granulosus s.l.)에 의해 발생하는 중요한 인수공통기생충 질환으로, 가축과 인간 모두에게 영향을 미칩니다. 이 질병은 단방조충의 알(충란)이 포함된 개의 분변에 오염된 음식이나 물을 섭취함으로써 감염됩니다. 따라서 개의 분변에서 이러한 충란을 정확히 검출하는 것은 질병 예방 및 관리 전략 수립에 매우 중요합니다. 이를 위해, 새롭고 정확하며 신속하고, 현장에서 바로 결과를 시각적으로 확인할 수 있는 진단검사법(Point-of-Care Test, POCT) 개발이 절실합니다. 방법: 연구팀은 재조합효소 중합효소 연쇄반응(Recombinase Polymerase Amplification, RPA) 기술과 크리스퍼 유전자 가위 기술(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR) 및 이와 연관된 단백질인 Cas12a (CRISPR-associated protein 12a) 시스템을 결합하여 "RPA-CRISPR/Cas12a 분석법"을 개발했습니다. 이 분석법은 단방조충의 미토콘드리아에 존재하는 nad2 유전자를 표적으로 하며, 검사 결과는 측방유동 스트립(lateral flow strip)을 통해 시각적으로 확인할 수 있도록 설계되었습니다. 또한, 현장 적용성을 높이기 위해 간단하고 비용 효율적인 수산화나트륨(NaOH) 기반 DNA 추출 방법을 통합했습니다. 개발된 분석법의 임상적 유효성을 검증하기 위해, 18마리의 개 분변 샘플에서 DNA를 추출하여 검사했으며, 그 결과를 정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative PCR, qPCR) 및 두 종류의 상용 효소면역측정법(ELISA) 키트 결과와 비교했습니다. (초록 후반부에는 총 62개 임상 샘플에 대한 결과가 제시되어, 초기 검증 후 더 많은 샘플로 확장하여 평가한 것으로 보입니다.) 결과: RPA-CRISPR/Cas12a 분석법은 DNA 농도 1 펨토그램/마이크로리터 (1 fg/μL)까지 검출할 수 있는 높은 민감도를 보였습니다. 또한, 다방조충(Echinococcus multilocularis), 개촌충(Dipylidium caninum), 개조충(Taenia hydatigera), 다두조충(Taenia multiceps), 콩알조충(Taenia pisiformis)과 같은 다른 유사한 촌충들과는 교차 반응을 보이지 않아 특이도가 높음을 확인했습니다. 62개의 개 분변 임상 샘플에 적용했을 때, RPA-CRISPR/Cas12a 분석법은 68%의 민감도를 나타냈고, NaOH 기반 DNA 추출법을 결합한 "RPA-CRISPR/Cas12a-NaOH 분석법"은 45%의 민감도를 보였습니다. RPA-CRISPR/Cas12a 및 RPA-CRISPR/Cas12a-NaOH 분석법의 현장 성능을 기존의 qPCR 및 두 가지 ELISA 키트와 비교했을 때, 민감도, 일치율, 유덴 지수(Youden's index)를 기준으로 현재 사용되는 검출 방법들과 양호하거나 보통 수준의 일치도를 나타냈습니다. 결론: 본 연구는 개의 분변에서 단방조충을 검출하기 위한 RPA-CRISPR/Cas12a 분석법과 RPA-CRISPR/Cas12a-NaOH 분석법을 성공적으로 개발하고 그 유효성을 검증했습니다. 개발된 분석법들은 기존의 검출 방법들보다 향상된 진단 민감도를 제공하며, 현장진단검사가 가능하다는 장점이 있습니다. 더 나아가, 이 분석법들은 저소득 국가에서 단방조충 감염 실태를 파악하고 감시하는 데 유용하게 활용될 잠재력을 가지고 있습니다. | 
DOI: 10.1371/journal.pntd.0012753
제목: 개의 분변에서 단방조충(Echinococcus granulosus) 검출을 위한 재조합효소 중합효소 연쇄반응(RPA)-CRISPR/Cas12a 분석법 개발및검증
배경:
낭성포충증(Cystic echinococcosis, CE)은 단방조충(Echinococcus granulosus sensu lato, E. granulosus s.l.)에 의해 발생하는 중요한 인수공통기생충 질환으로, 가축과 인간 모두에게 영향을 미칩니다. 이 질병은 단방조충의 알(충란)이 포함된 개의 분변에 오염된 음식이나 물을 섭취함으로써 감염됩니다. 따라서 개의 분변에서 이러한 충란을 정확히 검출하는 것은 질병 예방 및 관리 전략 수립에 매우 중요합니다. 이를 위해, 새롭고 정확하며 신속하고, 현장에서 바로 결과를 시각적으로 확인할 수 있는 진단검사법(Point-of-Care Test, POCT) 개발이 절실합니다.
방법:
연구팀은 재조합효소 중합효소 연쇄반응(Recombinase Polymerase Amplification, RPA) 기술과 크리스퍼 유전자 가위 기술(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR) 및 이와 연관된 단백질인 Cas12a (CRISPR-associated protein 12a) 시스템을 결합하여 "RPA-CRISPR/Cas12a 분석법"을 개발했습니다. 이 분석법은 단방조충의 미토콘드리아에 존재하는 nad2 유전자를 표적으로 하며, 검사 결과는 측방유동 스트립(lateral flow strip)을 통해 시각적으로 확인할 수 있도록 설계되었습니다.
또한, 현장 적용성을 높이기 위해 간단하고 비용 효율적인 수산화나트륨(NaOH) 기반 DNA 추출 방법을 통합했습니다. 개발된 분석법의 임상적 유효성을 검증하기 위해, 18마리의 개 분변 샘플에서 DNA를 추출하여 검사했으며, 그 결과를 정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative PCR, qPCR) 및 두 종류의 상용 효소면역측정법(ELISA) 키트 결과와 비교했습니다. (초록 후반부에는 총 62개 임상 샘플에 대한 결과가 제시되어, 초기 검증 후 더 많은 샘플로 확장하여 평가한 것으로 보입니다.)
결과:
RPA-CRISPR/Cas12a 분석법은 DNA 농도 1 펨토그램/마이크로리터 (1 fg/μL)까지 검출할 수 있는 높은 민감도를 보였습니다. 또한, 다방조충(Echinococcus multilocularis), 개촌충(Dipylidium caninum), 개조충(Taenia hydatigera), 다두조충(Taenia multiceps), 콩알조충(Taenia pisiformis)과 같은 다른 유사한 촌충들과는 교차 반응을 보이지 않아 특이도가 높음을 확인했습니다.
62개의 개 분변 임상 샘플에 적용했을 때, RPA-CRISPR/Cas12a 분석법은 68%의 민감도를 나타냈고, NaOH 기반 DNA 추출법을 결합한 "RPA-CRISPR/Cas12a-NaOH 분석법"은 45%의 민감도를 보였습니다. RPA-CRISPR/Cas12a 및 RPA-CRISPR/Cas12a-NaOH 분석법의 현장 성능을 기존의 qPCR 및 두 가지 ELISA 키트와 비교했을 때, 민감도, 일치율, 유덴 지수(Youden's index)를 기준으로 현재 사용되는 검출 방법들과 양호하거나 보통 수준의 일치도를 나타냈습니다.
결론:
본 연구는 개의 분변에서 단방조충을 검출하기 위한 RPA-CRISPR/Cas12a 분석법과 RPA-CRISPR/Cas12a-NaOH 분석법을 성공적으로 개발하고 그 유효성을 검증했습니다. 개발된 분석법들은 기존의 검출 방법들보다 향상된 진단 민감도를 제공하며, 현장진단검사가 가능하다는 장점이 있습니다. 더 나아가, 이 분석법들은 저소득 국가에서 단방조충 감염 실태를 파악하고 감시하는 데 유용하게 활용될 잠재력을 가지고 있습니다.