• DOI: 10.1186/s13071-024-06380-9

방광주혈흡충 진단을 위한 Sh-RPA 분석법 최적화 및 DNA 추출법 평가

이 논문은 **방광주혈흡충증(urogenital schistosomiasis)**의 원인 기생충인 방광주혈흡충(Schistosoma haematobium) 진단을 위한 신속하고 정확한 현장 진단법 개발에 관한 연구입니다. 특히, 재조합효소 중합효소 증폭(Recombinase Polymerase Amplification, RPA) 기반의 진단법인 Sh-RPA의 성능을 개선하고, 자원이 부족한 환경에서도 사용하기 적합한 DNA 추출 방법을 평가했습니다.

연구 배경:

• 방광주혈흡충증은 기생충인 방광주혈흡충에 의해 발생합니다.
• 이 질병을 퇴치하기 위해서는 민감도와 특이도가 높은 현장 진단(Point-of-Care, POC) 기술이 필수적입니다.
• RPA 분석법은 이러한 기준을 충족하며, 방광주혈흡충 진단을 위한 Sh-RPA 분석법이 이미 개발된 상태입니다.
• 하지만 Sh-RPA 분석법에서 위양성 결과가 발생할 수 있어, 이를 줄이기 위한 반응 조건 최적화가 필요합니다.
• 또한, 사용 편의성과 DNA 추출 방법의 호환성도 중요한 고려 사항입니다.

연구 방법:

1. Sh-RPA 반응 조건 최적화:

   • 베타인(betaine) 농도 조절: 합성 DNA, 방광주혈흡충 유전체 DNA(gDNA), 실제 환자의 소변 샘플을 사용하여 Sh-RPA 반응 시 베타인 농도를 0 M, 1 M, 2.5 M, 12.5 M로 다르게 첨가했습니다.
   • 샘플 대 물 비율 조절: 반응액 내 샘플 부피와 물의 비율을 조절하여 분석했습니다.
   • 평가 항목: 이러한 조건 변화가 분석법의 특이도(specificity, 질병이 없는 사람을 없다고 정확히 판단하는 능력)와 민감도(sensitivity, 질병이 있는 사람을 있다고 정확히 판단하는 능력)에 미치는 영향을 평가했습니다.

2. DNA 추출 키트 평가:

   • 자원이 부족한 환경에서 사용하기 적합한 5가지 상용 DNA 추출 키트를 선정했습니다.
   • 단일 방광주혈흡충 알(egg)로부터 각 키트를 사용해 gDNA를 추출했습니다.
   • 평가 항목: 추출된 DNA의 질, 양, 그리고 Sh-RPA 분석법과의 호환성을 평가했습니다.
   • 검증: 모든 샘플은 정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)으로도 분석하여 DNA 획득 여부를 확인했습니다.

연구 결과:

1. Sh-RPA 민감도:

   • 모든 베타인 농도 조건에서 Sh-RPA의 분석적 민감도는 합성 Dra1 표준물질(synthetic Dra1 standard) 기준 10개 복제본 이상, 방광주혈흡충 gDNA 기준 0.1 피코그램(pg)으로 높게 나타났습니다.

2. 베타인의 영향 및 최적 조건:

   • 베타인 첨가는 모든 반응 조건에서 Sh-RPA 분석법의 특이도를 향상시켰습니다.
   • 2.5 M 농도의 베타인을 첨가하고, 가능한 최대 샘플 부피인 12.7 마이크로리터(µl)를 사용하는 것이 최적의 반응 조건으로 확인되었습니다. 이 조건에서 특이도가 가장 효과적으로 개선되었습니다.

3. DNA 추출 키트 성능:

   • 선정된 5가지 상용 DNA 추출 키트 모두 단일 방광주혈흡충 알에서 성공적으로 DNA를 분리했습니다.
   • 그러나 추출된 DNA를 Sh-RPA 분석에 사용했을 때, 키트별로 성능에 차이를 보였습니다. 특히, 한 가지 키트는 RPA 반응과 호환되지 않는 것으로 나타났습니다.

결론:

• Sh-RPA 반응에 2.5 M의 베타인을 첨가하면 민감도에 부정적인 영향을 주지 않으면서도 반응 특이도를 향상시킬 수 있습니다. 이는 분석법의 견고성(robustness)을 높여, 자원이 부족한 환경에서 Sh-RPA 분석법을 사용하는 것의 실현 가능성을 증진시킵니다.
• 상용 추출 키트 테스트 결과, 조잡하고(crude) 빠르며(rapid) 간단한(simple) 방법으로도 단일 방광주혈흡충 알에서 충분한 DNA를 얻을 수 있으며, 이렇게 얻은 추출물은 대부분의 경우 Sh-RPA에 사용 가능함을 확인했습니다.
• 그러나 특정 키트가 Sh-RPA와 호환되지 않는 결과는, 분자 진단 플랫폼을 실제 현장에 적용하기 전에 각 단계(DNA 추출부터 증폭, 검출까지)를 철저히 검증해야 할 필요성을 강조합니다.

주요 용어:

• 방광주혈흡충 (Schistosoma haematobium): 연구 대상 기생충
• 진단 (Diagnostic): 질병 유무 판단
• 등온 (Isothermal): 일정한 온도에서 반응 진행 (RPA의 특징)
• 분자 (Molecular): DNA, RNA 등 분자 수준의 분석
• 현장 진단 (Point-of-care): 의료 시설 외부, 환자 가까이에서 즉시 수행하는 검사
• 재조합효소 중합효소 증폭 (Recombinase polymerase amplification, RPA): 연구에 사용된 주요 유전자 증폭 기술
• 주혈흡충증 (Schistosomiasis): 주혈흡충 감염으로 인한 질병
• 방광주혈흡충증 (Urogenital schistosomiasis): 방광 등 비뇨생식기에 발생하는 주혈흡충증

요약하자면, 이 연구는 베타인 첨가를 통해 Sh-RPA 진단법의 정확성을 높였으며, 다양한 DNA 추출법의 현장 적용 가능성을 평가하여 방광주혈흡충증의 효과적인 현장 진단법 개발에 기여했습니다. 또한, 진단 시스템의 각 구성 요소에 대한 철저한 검증의 중요성을 시사합니다.