유전자 기반연구

1. RPA와 RAA의 차이점은 무엇인가요?

RPA와 RAA는 모두 재조합효소 기반의 등온 증폭 방식입니다.

• RPA (Recombinase Polymerase Amplification): 재조합효소 중합효소 증폭.
• RAA (Recombinase Aided Amplification): 재조합효소 보조 증폭.

2. 적합한 RPA 키트를 어떻게 선택하나요? RPA 키트 간의 차이점은 무엇인가요? 

적합한 키트를 선택하려면, 필요한 요구사항을 파악하고 각 RPA 키트의 특징과 차이점을 이해해야 합니다.

• RPA Basic 키트: 주로 DNA 증폭에 사용되며, 특정 DNA 단편을 등온에서 수백만에서 수십억 배로 복제합니다. 증폭 산물은 아가로스 겔을 사용하여 관찰할 수 있습니다.
• RPA Exo 키트: RPA Basic 키트에 형광 프로브(Exo 프로브)를 추가하여 특이성을 향상시킵니다. 형광 값은 Q-PCR 장비를 사용하여 읽을 수 있습니다.
• RPA Nfo 키트: RPA Basic 키트에 측방 유동 프로브(Nfo 프로브)를 추가하여 특이성을 향상시킵니다. 결과는 테스트 스트립을 사용하여 읽을 수 있습니다.

경험 공유:

• RPA Exo 키트는 정량적 결과를 제공합니다. 프라이머 및 프로브 최적화에 적합합니다. Exo 키트에서 가장 효과적인 프라이머 세트와 프로브를 찾으면, Nfo 키트용 효과적인 프라이머 세트와 프로브도 쉽게 얻을 수 있습니다.

3. RPA용 프라이머와 프로브는 어떻게 디자인하나요?

프라이머 및 프로브 디자인을 위한 무료 온라인 소프트웨어를 제공합니다. (https://www.ezassay.com/en/primer)

먼저, 대상 DNA 서열을 FASTA 형식으로 대화 상자에 붙여넣습니다. 서버 계산 제한으로 인해 대상 서열이 너무 길어서는 안 됩니다. 일반적으로 80-500 bp면 충분합니다.

웹 출력은 정방향 및 역방향 프라이머의 다양한 조합을 보여줍니다. 정방향 프라이머를 고정하고 여러 역방향 프라이머를 선택할 수 있으며, 그 반대도 가능합니다. 각 조합은 다른 쌍을 나타냅니다. Excel 표를 다운로드하고 첫 번째 스크리닝 라운드를 위해 위에서 아래로 5-10개의 정방향 프라이머와 5-10개의 역방향 프라이머를 선택하여 최적의 조합을 식별합니다.

참고: 최상의 프라이머는 실험적 스크리닝을 통해 결정해야 합니다. 소프트웨어는 현재 이를 정확하게 예측할 수 없습니다. 이 점을 유념해 주십시오.

4. PCR 프라이머를 RPA 키트에 사용할 수 있나요?

네, 가능합니다. 하지만 증폭 메커니즘이 다르기 때문에 PCR에서 검증된 프라이머가 RPA에서 최적으로 작동하지 않을 수 있습니다. RPA에서는 프라이머 특이성과 민감도가 중요합니다. RPA 온라인 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 디자인한 다음 실험을 통해 스크리닝하여 최상의 프라이머 쌍을 선택하는 것이 좋습니다.

5. RPA 증폭의 DNA 겔 결과에 비특이적 밴드가 나타나는 이유는 무엇인가요? 

등온 증폭에서의 비특이적 산물은 고전적인 PCR보다 더 흔하다는 것을 인정해야 합니다. 이는 기술 고유의 메커니즘 때문입니다. 하지만 걱정하지 마십시오. 다음 해결책을 통해 최적화할 수 있습니다:

• 프라이머 최적화: RPA 프라이머는 일반적으로 세 번 이상의 스크리닝 과정을 거쳐야 합니다. 첫 번째 라운드에서는 증폭 영역의 차이를 최대화합니다. 두 번째 라운드에서는 첫 번째 라운드에서 최상의 프라이머 쌍을 선택합니다. 그런 다음 정방향 및 역방향 프라이머에 대해 각각 1~3개의 뉴클레오티드를 왼쪽이나 오른쪽으로 이동시켜 추가 스크리닝 및 최적화를 수행합니다.
• 프라이머 이합체 형성: 프라이머가 이합체를 형성하여 비특이적 밴드를 생성할 수 있습니다. 프라이머 농도를 조절하거나 프라이머를 재설계하면 이 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
• 온도: 반응 온도는 증폭의 특이성에 영향을 줄 수 있습니다. RPA는 일반적으로 39-41°C에서 가장 잘 작동합니다. 온도가 너무 낮으면 비특이적 증폭이 증가할 수 있습니다. 드라이 배스의 온도가 정확하지 않을 수 있습니다. 온도를 최적 범위로 조절하면 특이성을 향상시킬 수 있습니다.
• 프로브 도입: PCR의 TaqMan 프로브 디자인 원리에서 영감을 받아, RPA는 Exo 프로브, Nfo 프로브 또는 CRISPR-crRNA를 도입하여 검출 특이성을 크게 향상시킬 수 있습니다.

6. RPA Basic 키트 제품의 결과를 어떻게 해석하나요? DNA 정제가 필요한가요? 

증폭 산물은 DNA 아가로스 겔을 실행하여 시각화할 수 있습니다. 전기영동 전에 65°C에서 10분간 가열하여 반응을 종료하는 것이 좋습니다. 더 깨끗한 밴드를 위해 겔 전기영동 전에 제품을 정제하는 것은 선택 사항입니다. 제품 정제는 컬럼 기반, 마그네틱 비드 또는 기타 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 특정 절차는 정제 키트 설명서를 참조하십시오.

참고: RPA-Exo 키트의 제품은 엑소뉴클레아제가 제품을 분해하기 때문에 겔 전기영동으로 분석할 수 없습니다.

7. 음성 대조군에서 신호가 나타나는 이유는 무엇인가요? 

• 음성 대조군이 처음에는 신호가 없다가 나중에 신호가 나타나거나 신호가 매우 강하면, 이전 반응물의 오염(carry-over) 또는 에어로졸 오염 가능성이 높습니다. 새로운 시약을 사용하고 다른 환경에서 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 시료 첨가 순서 제안: 음성 대조군을 먼저 첨가하고, 시료를 첨가한 다음, 마지막으로 양성 대조군을 첨가합니다.

• 첫 실험에서 음성 대조군이 신호를 보인다면, 일반적으로 프라이머/프로브의 특이성이 낮아 비특이적 증폭이 발생했기 때문입니다. 프라이머와 프로브를 재설계하고 최적화하는 것이 좋습니다. 높은 프로브 농도 또한 비특이적 절단을 유발하여 배경 신호를 증가시킬 수 있습니다. (이 경우 신호는 보통 천천히 증가합니다.)

• 시약을 받으면 분주하여 보관하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 3~5개의 튜브로 나누어 동일한 튜브를 반복적으로 사용하여 교차 오염을 유발하는 것을 방지합니다.

• 팀은 UDG 효소를 추가하여 "오염 방지" RPA 키트를 제공합니다. 이는 IVD 제품 개발에 매우 유용합니다. 

8. RPA 등온 증폭의 민감도는 어느 정도인가요? 키트에 제공된 양성 대조군의 농도는 얼마인가요? 

RPA 키트의 민감도는 일반적으로 반응당 최소 10~100 카피에 도달할 수 있습니다. 키트 내 양성 대조군의 농도는 약 10^5 카피/μL입니다.

9. 양성 대조군 그룹에서 신호가 없는 이유는 무엇인가요? 

• PCR 써멀 사이클러를 사용하는 경우, 가열 뚜껑 기능이 꺼져 있는지 확인하십시오. "가열 뚜껑 끄기" 옵션을 미리 선택하고 프로그램을 실행하여 뚜껑이 식도록 할 수 있습니다. 특정 온도 조절에 대해서는 기기 모델에 따라 제조업체에 문의하십시오.
• 일반적으로 PCR/qPCR 기기의 가열 뚜껑은 전원을 켠 직후 105∘C까지 가열됩니다. 가열 뚜껑이 꺼져 있더라도 105∘C 상태로 남아 있다면, 반응 튜브를 넣기 전에 적절한 온도(예: 50∘C 미만)로 식을 때까지 기다리십시오. 그렇지 않으면 뚜껑에서 튜브 바닥으로의 열전도로 인해 효소가 부분적으로 또는 완전히 비활성화될 수 있습니다.

10. 양성 대조군은 잘 작동하는데, 샘플 그룹에서 신호가 없는 이유는 무엇인가요? 

• 템플릿 분해 또는 낮은 농도일 수 있습니다.
• 철저히 혼합해야 합니다. 템플릿을 추가한 후, 튜브를 여러 번 뒤집거나 가볍게 쳐서 잘 섞은 다음, 빠르게 원심분리합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다.
• 프라이머가 적합하지 않을 수 있습니다.
• 스타터(Starter)를 마지막에 추가하십시오. 스타터를 튜브 캡이나 벽에 적용하고(템플릿이나 시약에 직접 추가하지 않도록 주의), 잘 섞은 다음 빠르게 원심분리하는 것이 좋습니다.